COVİD’İ YAKALAYAN YAŞLI YÖNTEM PCR:
BERRA ARICA/KARADENİZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ/ MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK
GİRİŞ
Yaklaşık iki yıldır tüm dünyayı etkisi altına alarak evimize kapanmamıza, normallerimizin değişmesine sebep olan corona virüs nedeniyle adını duyduğumuz bazı terimler bugünlerde hayatımız da daha fazla yer alıyor. Bu terimlerin başında covid-19 tespiti sağlayan pcr,pcr test,real time pcr peki, bu pcr ne? Nasıl çalışıyor? Yanlış sonuç çıkar mı? Çıkarsa nedeni nedir? bunlar gibi pek çok soru son zamanlar da hepimizin kafasını kurcalıyor.
PCR amino asitlerin belirli koşullarda tüpte çoğaltılması olarak kabaca anlatılabilir.
PCR aslında uzun zamandır kullanılan bir yöntem, pek çok uygulama alanı bulunmakta. Bunlar;
- HIV,
- Herpes,
- Çeşitli genital enfeksiyonlar, özellikle klamidya, ureaplasmosis, gardnerellosis, mikoplazmoz ve trikomoniyaz,
- Kandidiyazis,
- Hepatit,
- Mononükleoz,
- Listerioz,
- Sitomegalovirüs,
- Tüberküloz,
- İnsan papilloma virüsü
- Kene kaynaklı ensefalittir.
PCR ÇEŞİTLERİ
1.Yuvalanmış ( Nested ) PCR
ilk yöntemimiz nested PCR bu yöntem iki aşamalı bir PCR’dır. İki kere PCR yapılıyor diyebiliriz. İlk PCR özgün (saf) olmayan ürünleri oluşturur böylece bu ürünler 2.PCR için kalıp olarak kullanılır ve asıl istenilen bölge çoğaltılarak özgün(saf) ürünler elde edilmektedir. (2.PCR Nested Primerleri kullanır bu primerler diziye özgürdür) Böylece saf olmayan sonuçlar engellenmekte bu da yöntemimizi yüksek özgünlükte bir PCR yöntemi yapmaktadır.
Bu uygulama:
- Hastalıkların teşhisinde
- Genetiği değiştirilmiş organizmaların teşhisinde
- Gen ekspresyonun da kullanılmaktadır.
2.Demirlenmiş ( Anchored ) PCR
ikinci yöntemimiz anchored PCR bu yöntem çoğaltılacak DNA’nın sadece bir bölgesi biliniyorsa kullanılır. Bilinen bir bölgeye bağlanarak kullanılır.Çoğaltılacak DNA bilinen bir diziye bağlanır ve bu dizi 2. Primer bölgesi olarak kullanılmaktadır.
3.Çoklu (Multipleks) PCR
Bu yöntem kistik fibrozis gibi genetik hastalıkların tanısında kullanılabilir, ayrıca bu yöntem sonucun da örnek alınan hastanede salgın olup olmadığı yorumlanabilmektedir.
Yöntemimiz bir PCR ile birden fazla dizinin çoğaltılması olarak tanımlanabilir, hastalardan alınan DNA örneklerinin santrifüjleriyle başlanır enzimle katılaşır ve enzim kesimi ardından tampona dökülür. Ardından prosedür izlenir ve halkaların renklenmesi sağlanır bu PCR Bakteri DNA fotoğrafını çekiyor da diyebiliriz(Agarozjel elektroforezi) bu sayede halkaların sıklığı bulunduğu yerlere bakarak diğer örneklerle kıyaslanabilmektedir.
4.in Situ PCR
Bu yöntem viral DNA’nın ve tek kopyalı genlerin saptanmasında veya RT-PCR ile birlikte viral RNA ve transkriptlerin belirlenmesinde kullanılır. Lam üzerindeki hücre, doku ya da doku parçaları içindeki kalıp DNA’nın PCR ile çoğaltılması işlemidir.
5.Asimetrik PCR
Bu yöntem fazla miktarda çoğaltılan tek iplikli ürünün dizilenmesi için kullanılır.
Kullanılan primerlerden biri diğerinden miktarca çok daha fazladır (asimetrik), Asimetrik PCR herhangi bir kalıp ipliğe uygulanabilir ancak tek iplikli ürünün fazla miktarda üretilememesi gibi bir sorunla karşılaşılabilir. Bu nedenle çoğunlukla klasik PCR ile önce çift iplikli hedef DNA çoğaltılır, ardından asimetrik PCR uygulamasıyla kalıp yeniden çoğaltılarak tek iplikli ürün yeterli miktarda üretilir.
6.Ters (Inverse) PCR
Bilinen DNA dizileri kullanılarak, bilinmeyen DNA dizilerinin çoğaltılmasında kullanılmaktadır. Bilinen diziler ters çevrilir bu yüzden böyle adlandırılır.
7.Geri(Revers) PCR
RNA PCR olarak da adlandırılır(RT-PCR). RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi (geri transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA’nın da standart PCR yoluyla çoğaltılmasıdır.
Bu yöntem
- HIV-1
- M-MLV
- AMV kullanılır.
8.Real Time PCR
Bu yöntem covid’in çalışıldığı yöntemdir. Ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır bu nedenle agarozjel elektroforezi gibi yöntemlere gerek kalmamaktadır. Analizinde diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır.
PCR çeşitleri ve özellikleri böyleyse hastaneler de oluşan yanlış sonuçlar nasıl oluyor?
Bu sorunun cevabını verebilmek için öncelikle real time PCR’ın nasıl yorumlandığını anlamalıyız:
- Covid örneklerimizi ve pozitif, negaitif kontrollerimizi PCR makinemizin mix karışımından dağıtıyoruz.
- Bu karışımlarla birleşince disklere yerleştirip programını kuruyoruz
- Program 30-40 dakika da sonuçları bir grafik şeklinde veriyor.
- Çıkan tabloda önceliğimiz pozitif ve negatif kontrollerimize bakmak oluyor eğer pozitif kontrolümüz 25’den sonra ivmeli bir yükselme yapmış ise bir sorun yok demektir. (Negatif kontrolün hiç yükselmemesi gerekir)
- Bir problem yok ise hastaların örneklerine bakılır ve ivme yapanlar pozitif kontrolle karşılaştırılır ve hastaya sonucu verilir.
- mix karışımı beklemişse ya da pozitif kontrol bozulmuşsa yanlış sonuçlar verilebilmektedir.
Sonuç
Bu yazıdan da anlayabileceğimiz gibi PCR önceden de kullandığımız etkili ve güvenilir bir yöntemdir.
Yanlış sonucun ana nedenleri
- Örneği veren hastanın yanlış vermesi (örnek öncesi asitli yiyecek içecek tüketimi, kullanılan ilaçların belirtilmemesi, varsa hastalıkların belirtilmemesi, bazı PCR’lar uygunsuz zamanda alınan numunenin verilmesi durumu.)
- Örneği alan görevlinin yanlış şekilde numune alımı
- PCR yapan görevliden kaynaklı sorunlar (tecrübe yetersizliği, bilgi eksikliği, çalışma ortamının yetersizliği, dikkatsizlik vb.) bunlardır.
Bu durumları düzeltmesi için toplumsal farkındalığın sağlanması hizmet içi eğitimlerin yaygınlaştırılması, çalışma koşullarını iyileştirilmesi ve gerektiğinde denetlenmesi gibi öneriler sunulabilir.
Kaynakça:
- https://bys.trakya.edu.tr/file/open/44259122
- atlasbiyo.com/dosyalar/konferans/15506cc8d91e01.pdf
- https://docplayer.biz.tr/58558250-Polimeraz-zincir-reaksiyonu-pcr-polymerase-chain-reaction-ayten-askin-kilinc-veteriner-hekim.html
- https://laikaspoetnik.wordpress.com/tag/pcr/
- https://www.ebi.ac.uk/training/online/course/functional-genomics-ii-common-technologies-and-data-analysis-methods/real-time-pcr
- https://labakademi.com/pcr-cesitleri/
- https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12928752/
